В рамках VI Международной программы научных грантов Института перспективных исследований Московского педагогического государственного университета 2 марта 2021 года состоялся научно-экспертный семинар лауреата программы профессора Ровшана Ибрагимхалиловича Халилова – зав.кафедрой Биофизики и биохимии Бакинского Государственного Университета, Республика Азербайджан на тему «Применение метода ЭПР спектроскопии в оценке экологических стрессовых состояний живых систем». Семинар для студентов и преподавателей Географичекого факультета был организован ИПИ (зав.отделом Е.И. Зиганчина) и зав.кафедрой зав. кафедрой экологии и природопользования Географического факультета МПГУ доцент В.И. Ерошенко
Модератором семинара являлся главный научный сотрудник ИПИ профессор Ренад Ибрагимович Жданов, известный специалист в области биомедицинских приложений метода ЭПР. В качестве экспертов научно-экспертного семинара выступили профессор А.Е. Кив, профессор Университета им. Д. Бен-Гуриона в Негеве (Израиль), профессор Г.Б. Хомутов, Физический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (Россия), а также профессор А. Эфтехари (Aziz Eftekhari), Университет медицинских наук г. Тебриза (Република Иран). В своем выступлении профессор Р.И. Халилов изложил основные результаты своих научно-исследовательских работ в области изучения экологии живых систем методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Краткое содержание его выступления состоит в следующем. В условиях усиления антропогенной нагрузки на окружающую среду происходит все большое ее загрязнение физическими и химическими факторами и как следствие ухудшается качество среды обитания живых организмов. Атмосферный воздух, почва и вода загрязняются такими веществами как тяжелые металлы, гербициды, пестициды, различные ядовитые отходы производства. В результате воздействия таких стрессоров в организмах возникают свободные радикалы и другие токсичные вещества, в том числе активные формы кислорода (АФК), представляющие серьезную опасность для всех форм жизни. При некотором пороговом уровне внешнего воздействия клетки растений скачкообразно переходят на новый уровень метаболизма, который представляет состояние повышенной устойчивости растительной клетки под воздействием стресса. С другой стороны, в результате загрязнения стратосферы происходит уменьшение озонового слоя, а это увеличивает интенсивность ультрафиолетовой (УФ) радиации, особенно ее диапазон Б (280-320 нм). В результате уменьшения озонового слоя даже малейшее увеличение на Земле УФ-излучения приводит к побочным экологическим явлениям, поэтому воздействие различных стресс факторов на живые организмы вызывает большой научный и практический интерес. Многие годы нами проводятся радиоэкологические исследования на ряде территорий Апшеронского полуострова. Для оценки экологических стрессовых состояний живых систем мы применяем в основном метод ЭПР. С целью изучения влияние радиоактивного загрязнения на некоторые виды растений были проведены сравнительные эксперименты с контрольными и подвергшимися облучению хронической радиации растениями методом ЭПР.
В наших исследованиях методом ЭПР были использованы высушенные образцы растений (Foeniculum vulgare, Vicia faba, Hibiscus Rose sinesis). В широком интервале магнитного поля (150-450 мТл) при комнатной температуре наблюдался характеристичный сигнал ЭПР (Foeniculum vulgare). Сравнительный анализ сигналов ЭПР показал, что некоторые дозы радиации влияют на число парамагнитных центров. Проводились также in vivo исследования для изучения влияния УФ- и гамма-радиации на растения. В исследованиях использовали листья растений Vicia faba и Hibiscus Rose sinesis. Результаты экспериментов, проведенных с листьями бобов показаны на рис.1. На фоне типичного темнового сигнала ЭПР (2) под влиянием «дальнего красного света» образуется сигнал ЭПР (1). При величине магнитного поля ΔН=200 мТл появляется и шестикомпонентный сигнал ЭПР ионов марганца (Mn2+). Кинетические измерения показывают, что под влиянием «интенсивного белого света» генерируется сигнал Р700+ маленькой амплитуды. Действие монохроматического света λ=707 нм приводит к значительным изменениям в амплитуде сигнала и образуется состояние насыщения. Далее под действием белого света в кинетике видны немонотонные изменения. Причиной этому может быть и окисление во внутреннем пространстве тилакоидных мембран под воздействием света, и увеличение потока электронов на акцепторной части ФС1.
Рис.1. Кинетика фотоиндуцированных изменений сигнала ЭПР 1 в листьях бобов (А), темновой сигнал ЭПР 2 (1), сигнал ЭПР 1 образующийся под действием дальнего красного света с длиной волны λ=707 нм (2)-В, шестикомпонентный сигнал ЭПР ионов Мн2+ (С).
Под воздействием белого света в электрон-транспортных центрах (ЭТЦ) скорость электронов значительно отличается в листьях, подвергшихся УФ-радиации (рис.2). Как видно на рисунке 2, во время кинетических измерений под воздействием белого света амплитуда окислительно-восcтановительных превращений Р700+ по сравнению с контролем достигает большего значения, и действие белого света на фоне монохроматического света приводит к более значительному изменению. Поэтому можно прийти к выводу, что под воздействием УФ-радиации скорость потока электронов в акцепторной части ускоряется. Ускорение скорости электронов на акцепторной части ФС 1 может быть показателем ускорения фотодыхания. С помощью in vivo исследований установлено, что в листьях Vicia faba и Rose sinessis УФ-радиация в некоторых дозах создает функциональные изменения, но под действием гамма-радиации в in vivo исследованиях по сравнению с контролем значительных изменений не обнаружено. Так как в листьях китайской розы и бобов при комнатной температуре влияние гамма-радиации не изменяло амплитуду сигналов ЭПР 1 и ЭПР 2. Кинетика окислительно-восстановительных превращений реакционных центров Р700 фотосистемы 1 не отличилась от контрольного варианта. С помощью in vivo исследований обнаружено, что в листьях бобов и китайской розы в значительной дозе УФ-радиация создает функциональные изменения. Чтобы выяснить молекулярный механизм этих процессов мы провели in vitro исследования. Обнаружили, что ФС 2 более чувствительна к УФ-облучению.
Рис.2. Кинетика окислительно-восстановительных превращений Р700+ в листьях бобов облученных 20 минут УФ-В радиацией; (А) сигналы ЭПР 1 и ЭПР 2 (В); сигнал ЭПР ионов Мn2+ (С).
В проведенных исследованиях методом ЭПР во фрагментах ФС 2 в темноте обнаружен сигнал ЭПР 2. В субхлоропластных частицах ФС 2 определены одна из активных форм кислорода (АФК) и перекись водорода и изучена зависимость их выделения от дозы УФ-радиации. Для этого использовали реакционную систему люминол-пероксидазы. Во время экспериментов образцы облучали в темноте и на свету. Полученные хемилюминесцентные кривые сравнивали с контрольными кривыми. Установлено, что в облученных УФ-радиацией фрагментах ФС 2 интенсивность сигнала хемилюминесценции увеличивается и при облучении на свету амплитуда сигнала более высокая. Было обнаружено, в частности, что ионизирующая радиация в повышенных дозах действует на световую стадию фотосинтеза.
Профессор Р.И. Халилов в своем выступлении также рассказал о работах российских ученых, посвященных применению метода ЭПР в биологии и медицине (А.Ф. Ванин, Г.Б. Хомутов, А.Н. Тихонов и др.). Двухатомная молекула оксида азота NO играет исключительно важную роль в качестве универсального регулятора клеточного и тканевого метаболизма. Многочисленные исследования последних лет показали, что молекула NO используется в системе регуляции кровяного давления, в развитии иммунной реакции и, вероятно, является важным биохимическим компонентом в системе долговременной памяти. Было обнаружено, что оксид азота является нейромедиатором, то есть выполняет роль переносчика сигналов в нервной системе. Установлено, в частности, что образование избыточного количества NO может быть связано с возникновением некоторых патологических состояний центральной нервной системы, включая судорожные расстройства. Понятно, почему все больший интерес к изучению свойств и механизмов регуляторного действия NO радикалов проявляют биохимики, физиологи и врачи. Ученые были поражены тем, что такие важные функции в организме выполняет простая молекула двухатомного газа. И неслучайно, что в 1992 году молекула NO была удостоена звания “Молекула года”, а в 1998 г. группе американских ученых «за открытие роли оксида азота как сигнальной молекулы в регуляции сердечнососудистой системы» была прнсуждена Нобелевская премия.
В лекции были рассмотрены также некоторые примеры, иллюстрирующие, информацию о функционировании биологических систем, которую можно получить методом ЭПР. Оказывается, что во многих случаях использование метода ЭПР является не только удобным, но часто и единственным способом узнать о механизмах внутриклеточных процессов. Однако возможности нашего подхода не ограничиваются лишь измерениями собственных сигналов ЭПР от различных компонент исследуемой системы. Другое направление биологических применений метода ЭПР, которое активно развивается уже более трех десятилетий, заключается в использовании искусственных и некоторых природных парамагнитных соединений. Эти соединения вводят в исследуемую систему в качестве молекулярных зондов. После выступления проф. Р.Халилова была плодотворная дискуссия, в которой участвовали приглашенные эексперты.
